Определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Важная и проверенная информация на тему: "определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи" от профессионалов для спортсменов и новичков.

Определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи

До работы Cэнгера на выполнение которой ушло несколько лет, не было уверенности в том, что все молекулы данного белка являются строго идентичными по молекулярной массе и аминокислотному составу. В настоящее время известна аминокислотная последовательность многих сотен белков, выделенных из различных источников. Определение аминокислотной последовательности полипептцдной цепи основано на принципах, которые впервые были развиты Сэнгером. Они используются еще и сегодня, правда со всевозможными вариациями и усовершенствованиями.

Чтобы расшифровать аминокислотную последовательность любого полипептида, необходимо осуществить шесть основных стадий.

а. Стадия 1: определение аминокислотного состава

Первым шагом на пути к расшифровке аминокислотной последовательности служит гидролиз всех пептидных связей чистого полипептида. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии (разд. 5.18), что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате.

б. Стадия 2: идентификация амино- и карбоксиконцевых остатков

Следующий шаг состоит в идентификации аминокислотного остатка, находящегося на конце полипептидной цепи, несущего свободную

-аминогруппу, т. е. на аминоконце (-конце, или N-конце). Для этой цели Сэнгер предложил использовать реагент, 1 -фтор-2,4-динитробензол (разд. 5.22), который можно присоединить в качестве метки к аминоконцевому (-концевому) остатку цепи, в результате чего образуется окрашенное в желтый цвет (ДНФ) — производное полипептида. При кислотном гидролизе все пептидные связи в таком ДНФ — производном полипептида расщепляются, однако ковалентная связь между 2,4-динитрофенильной группой и -аминогруппой N-концевого остатка остается незатронутой. Следовательно, N-концевой остаток будет представлен в гидролизате в виде 2,4 производного (рис. 6-6).

Рис. 6-6. Идентификация аминоконцевого остатка тетрапептида путем получения 2,4-динитрофенильного производного. Тетрапептид вступает в реакцию с 1 -фтор-2,4-динитробензолом (ФДНБ) с образованием 2,4-дииитрофенильного производного. Последнее подвергают затем кипячению в присутствии 6 н. HCl с тем, чтобы расщепить все пептидные связи. При этом аминоконпевая аминокислота остается в виде 2,4-динитрофенильного производного.

Рис. 6-7. Введение метки в аминоконцевой остаток трипептида с помощью дансилхлорида. После гидролитического расщепления всех пептидных связей дансильное производное аминоконцевой аминокислоты можно выделить и идентифицировать. Благодаря интенсивной флуоресценции дансильных групп они выявляются в значительно меньших количествах, чем динитрофенильные группы. Поэтому дан — сильный метод по чувствительности намного превосходит метод с использованием фтординитробензола.

Это производное легко отделить от незамещенных свободных аминокислот и идентифицировать хроматографическим способом путем сравнения его с аутентичными динитрофенильными производными различных аминокислот.

Другим реагентом, используемым в качестве метки, позволяющей идентифицировать N-концевой остаток, служит дансилхлорид (рис. 6-7), который реагирует со свободной

-аминогруппой и дает дансильное производное. Последнее интенсивно флуоресцирует, вследствие чего его можно обнаружить и измерить при значительно более низких концентрациях, чем динитрофенильные производные.

Карбоксиконцевой (С-концевой) аминокислотный остаток полипептидной цепи тоже можно идентифицировать, используя тот или иной метод. Один из таких методов состоит в инкубировании полипептида с ферментом карбоксипептидазой, которая гидролизует только пептидную связь, находящуюся на карбоксильном конце (

-конце, или С-конце) цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-конце-вой остаток.

В результате идентификации N- и С-концевых остатков полипептида мы получаем две важные реперные точки для определения аминокислотной последовательности.

в. Стадия 3: расщепление полипептидной цепи на фрагменты

Теперь мы берем еще одну порцию анализируемого препарата, содержащего неповрежденные полипептидные цепи, и расщепляем их на более мелкие куски — короткие пептиды, состоящие в среднем из 10-15 аминокислотных остатков. Цель этой операции заключается в том, чтобы разделить полученные фрагменты и определить в каждом из них аминокислотную последовательность.

Для расщепления полипептидной цепи на отдельные фрагменты можно использовать несколько методов. Один из широко распространенных методов — это частичный ферментативный гидролиз полипептида под воздействием пищеварительного фермента трипсина. Каталитическое действие этого фермента отличается высокой специфичностью: гидролизу подвергаются только те пептидные связи, в образовании которых участвовала карбоксильная группа остатка лизина или аргинина независимо от длины и аминокислотной последовательности полипептидной цепи (табл. 6-6). Число более мелких пептидов, образующихся под действием трипсина, можно, следовательно, предсказать, исходя из общего числа остатков лизина и аргинина в исходном полипептиде.

Таблица 6-6. Специфичность, свойственная четырем важным методам фрагментации полипептидных цепей

Рис. 6-8. Пептидная карта, полученная после расщепления нормального гемоглобина человека трипсином. Каждое пятно содержит один из пептидов. Чтобы получить такую двумерную карту, смесь пептидов наносят на лист бумаги квадратной формы, проводят электрофорез в одном направлении, параллельном одной из сторон квадрата, после чего бумагу высушивают, а затем проводят хроматографическое разделение пептидов в другом направлении, перпендикулярном первому. Ни один из этих двух процессов в отдельности не позволяет разделить пептиды полностью, однако последовательное их осуществление оказывается очень эффективным способом разделения сложных пептидных смесей.

Читайте так же:  Аргинин 500 мг инструкция по применению

Полипептид, в котором содержатся пять остатков лизина и (или) аргинина, при расщеплении трипсином обычно дает шесть более мелких пептидов, причем все эти пептиды, за исключением одного, имеют на карбоксильном конце остаток лизина или аргинина. Фрагменты, полученные под действием трипсина, разделяют либо методом ионообменной хроматографии на колонке, либо при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге; при этом часто проводят двумерное хроматографическое разделение пептидов на листе бумаги, в результате чего получают хроматограмму с распределившимися на ней пептидами в виде пептидной карты (рис. 6-8).

г. Стадия 4: определение последовательности пептидных фрагментов

Укороченный пептид снова подвергается той же серии реакций, что позволяет идентифицировать новый

-концевой остаток. Повторяя таким образом отщепление одного за другим -концевых остатков, можно легко определить аминокислотную последовательность пептидов, состоящих из 10-20 остатков.

Определение аминокислотной последовательности проводится для всех пептидов, образовавшихся под действием трипсина. После этого сразу же возникает новая проблема — определить, в каком порядке трипсиновые фрагменты располагались в первоначальной полипептидной цепи.

д. Стадия 5: расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом

Рис. 6-9. Схема определения аминокислотной последовательности пептида путем его расщепления по Эдману. Исходный тетрапептид вступает в реакцию с фенилизотиоцианатом, в результате чего образуется фенилтиокарбамоильное производное аминоконцевого остатка. Этот остаток отщепляют от пептида без разрыва других пептидных связей и получают в виде фенилтиогидантоинового производного, которое можно идентифицировать хроматографическим способом. Оставшийся трипептид вновь проводят через тот же цикл реакций, что позволяет идентифицировать второй остаток. Эти операции повторяют до тех пор, пока не будут идентифицированы все остатки.

Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо иным способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи, устойчивые к действию трипсина. В этом случае более предпочтительным часто оказывается не ферментативный, а химический метод.

Особенно хорошие результаты дает реагент бромциан, расщепляющий только те пептидные связи, в которых карбонильная группа принадлежит остатку метионина (табл. 6-6). Следовагельно, если полипептид содержит восемь остатков метионина, то при обработке бромцианом обычно образуются девять пептидных фрагментов. Полученные таким способом фрагменты можно разделить методом электрофореза или хроматографии. Каждый из этих коротких пептидов подвергают расщеплению по Эдману, как было описано для стадии 4, и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность.

Итак, мы получили два набора пептидных фрагментов — один после обработки исходного полипептида трипсином и другой после химического расщепления того же полипептида бромцианом. Мы знаем также аминокислотную последовательность каждого пептида, входящего в состав этих двух наборов.

Рис. 6-10. Расположение пептидных фрагментов в правильном порядке на основе данных по перекрывающимся участкам. В приведенном здесь примере полипептид, состоящий из 16 аминокислотных остатков, после идентификации N- и С-концевых остагков был подвергнут фрагментации двумя способами. Вверху показаны полученные фрагменты, а снизу — воссоздание полной последовательности полипептида по перекрывающимся участкам.

е. Стадия 6: установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся участкам

Теперь сравнивают аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами из исходного полипептида, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых бы последовательности отдельных участков перекрывались (т.е. совпадали) с последовательностями тех или иных участков в пептидах первого набора. Принцип расположения пептидов показан на рис. 6-10. Пептиды из второго набора с перекрывающимися последовательностями позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи. Более того, эти два набора фрагментов позволяют выявить возможные ошибки в определении аминокислотной последовательности каждого фрагмента.

Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, чтобы найти перекрывающиеся участки для двух или более пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а то и четвертый способ расщепления, что позволяет в конце концов получить набор пептидов, обеспечивающих перекрывание всех участков, необходимых для установления полной последовательности исходной цепи. При этом для расщепления полипептида можно использовать другие протеолитические ферменты, например химотрипсин или пепсин, правда зти ферменты расщепляют пептидные связи гораздо менее избирательно, чем трипсин (табл. 6-6).

Определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Рассмотрим сначала, как можно определить последовательность аминокислот в коротком пептиде. Допустим, что пептид состоит из 6 аминокислотных остатков, расположенных в следующей последовательности;

(Для обозначения аминокислот использованы общепринятые сокращения, приведенные в табл. 2.1, стр. 23.) Прежде всего необходимо определить аминокислотиый состав пептида. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагреванием до 110°С в течение

Далее аминокислоты полученного гидролизага разделяют методом ионообменной

хроматографии на колонке с сульфонированным полистиролом. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином:

Читайте так же:  Какой лучше взять креатин
-аминокислоты дают с нингидрином интенсивное синее окрашивание, а иминокислоты, например пролин — желтое.

Рис. 2.26. Аминокислоты, содержащиеся в гидролизате белка, разделяют методом ионообменной хроматографии на сульфонированном полистироле (например, дауэкс-50). Для элюции аминокислот с колонки используют буферы с возрастающим значением рН. Первым снимается с колонки аспартат, имеющий кислотную боковую цепь; аргинин с основной боковой цепью элюируется последним. По оси ординат отложено поглощение.

Метод ионообменной хроматографии обладает высокой чувствительностью: с его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т.е. примерно столько, сколько содержится в одном отпечатке пальца. Количество аминокислоты пропорционально оптической плотности раствора после нагревания с нингидринйм. Если требуется определить еще меньшие количества аминокислоты — порядка нескольких нанограммов, то используют флуорескамин, который реагирует с

-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение. О природе аминокислоты судят по объему элюции, т. е. по объему буфера, использованному для вымывания данной аминокислоты с колонии (рис. 2.26). Сравнение результатов хроматографии гидролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептид имеет следующий аминокислотный состав:

Скобки показывают, что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде.

Рис. 2.27. (см. скан) Определение N-концевого остатка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реактив Сэнгера) и затем гидролизуют. ДНФ-производное аминокислоты (в приведенном примере ДНФ-аланин) идентифицируют по хроматографическим характеристикам.

Для определения в белке или пептиде концевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную к о валентную связь с азотом аминогруппы (рис. 2.27). Впервые для этой цели Сэнгер использовал фтординитробензол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной

с образованием динитрофенильного (ДНФ) производного пептида желтого цвета. Связь между ДНФ и концевой аминогруппой стабильна в условиях, используемых для гидролиза пептидных связей. Поэтому при гидролизе ДНФ-произ-водного пептида в высвобождается ДНФ-аминокислота, которую можно идентифицировать хроматографически как ДНФ-аланин.

Для идентификации N-концевых аминокислот в настоящее время часто используют дансилхлорид, который при взаимодействии с аминогруппой дает стабильное, ин тенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод позволяет выявить N-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных

[3]

связей), присутствующую в таком незначительном количестве, как несколько нано-граммов.

При всех достоинствах методов определения N-концевых аминокислотных остатков с помощью ДНФ или данейлхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому же пептиду, поскольку последний полностью распадается при кислотном гидролизе. Перу Эдману (P. Edman) удалось разработать метод маркирования N-концевого остатка и отщепления его от пептида без сопутс

вующего расщепления остальных пептидных связей. Деградация по Эдману (реакция Эдмана) состоит в ступенчатом (по одному) отщеплении аминокислотных остатков с амино-конца пептида (рис. 2.28). Фенилизотиоцианат реагирует с незаряженной концевой

аминогруппой пептида с образованием фенилтиокарбамоильного производного. Далее в слабокислой среде происходит отщепление циклического производного N-концевой аминокислоты, а оставшийся неразрушенным пептид оказывается укороченным на один аминокислотный остаток, Указанное циклическое производное представляет собой фенилтиогидантоин-аминокислоту (ФТГ-аминокислоту). Его идентифицируют методом хроматографии, Далее аминокислотный состав укороченного пептида

сравнивают с исходным:

Оказывается, что различие состоит в одном остатке аланина. Следовательно, в исходном пептиде аланин занимает N-концевое положение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить на укороченном пептиде. Исходя из аминокислотного состава после второй ступени деградации

можно прийти к выводу, что вторым остатком с N-конца является глицин. Это заключение подтверждают путем хроматографической идентификации ФТГ-глицина, полученного на второй ступени деградации пептида. Еще три ступени деградации по Эдману позволяют полностью раскрыть последовательность аминокислот во взятом пептиде.

Стратегию анализа последовательности аминокислот в белках можно определить как «разделяй и властвуй». Белок подвергают специфическому расщеплению на более короткие пептиды, последовательность аминокислот в которых определяют по Эдману. Специфическое расщепление можно производить химическими или ферментативным методами. Так, Б. Уиткоп (В. Witkop) и Э. Гросс (Е. Gross) обнаружили, что бромистый циан

расщепляет полииептидную цепь только по пептидной связи, образованной карбоксильной группой остатка метионина (рис. 2.29). Если в белке содержится 10 метиониновых остатков, то после обработки бромистым цианом обычно получается 11 пептидов. Высокоспецифическое расщепление достигается также с помощью трипсина — протеолитического фермента поджелудочной железы. Трипсин расщепляет полипептидные цепи по пептидной связи, образованной карбоксильной группой остатков аргинина и лизина (рис. 2.30). В результате белок, содержащий 9 остатков лизина и 7 остатков аргинина, после расщепления трипсином распадается на 17 пептидов. Каждый из этих пептидов, кроме пептида, расположенною на карбоксильном конце белка, будет кончаться аргинином или лизином. Ряд других способов специфического расщепления полипептидных цепей приведен в табл, 2.2.

Пептиды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когда последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помощью так называемых перекрывающихся пептидов (рис. 2.31). При этом используют уже не трипсин, а какой-либо фермент, расщепляющий полипептидную цепь в других участках, например химотрипсин, который расщепляет пептидные связи главным образом по

Читайте так же:  Как пить л карнитин жидкий

(кликните для просмотра скана)

Бромистый циан расщепляет полипептиды по карбоксильной группе метиониновых остатков.

карбоксильным группам ароматических и других больших неполярных аминокислотных остатков. Пептиды, образующиеся под действием химотрипсина, неизбежно перекрывают два или более триптических пептида, что используется для установления их последовательности. Таким путем полностью определяют последовательность аминокислот в белке.

Видео (кликните для воспроизведения).

Описанные методы применимы к белкам, состоящим из одной полипептидной цепи, не имеющей дисульфидных связей. В тех же случаях, когда в белке имеются дисульфидные связи или более одной полипептидной цепи, то необходимы дополнительные методические приемы, Например, если белок содержит две или более полипептидные цепи, соединенные нековалентными связями, то, воздействуя денатурирующими агентами, такими, как мочевина или гуанидингидрохлорид, вызывают диссоциацию цепей. Диссоциированные цепи разделяют и только после этого приступают к определению последовательности аминокислот в каждой из них. Если же полипептидные цепи соединены ковалентными дисульфидными связями, как это имеет место в инсулине, то их окисляют надмуравьиной кислотой; при этом дисульфвдные связи разрываются и образуются остатки цистеиновой кислоты (рис. 2.32).

Анализ структуры белков удалось значительно ускорить путем создания секвенато-распециального прибора для автоматического определения последовательности аминокислот. При таком определении белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается деградации по Эдману.

Таблида 2.2. (см. скан) Специфическое расщепление полипептидов

Реактивы и растворители проходят над иммобилизованной белковой пленкой, а высвобождающиеся ФТГ-аминокислоты подвергаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом идентифицируются. Один цикл деградации по Эдману занимает при этом менее двух часов. С помощью секвенатора можно определить аминокислотную последовательность полипептида или белка, содержащего до ста аминокислотных остатков.

Методы определения С-концевой аминокислоты

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который основан на гидразинолизе полипептида:

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия. В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируемый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последовательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность аминокислот в которых может быть точно определена описанными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных определенными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептидные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и лизина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза – в другом , под углом 90° от первого (пептидная карта).

Читайте так же:  Л карнитин при подагре

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954]. Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 аминокислотных остатка), α-цепи (141) и β-цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про-инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипептидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислотный остаток) схематически можно представить следующим образом:

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль-фидные (—S—S—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули-

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и кашалота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Муром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124 аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицинское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера-зы (в частности, последовательности ее β- и β 1 -субъединиц, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно фактора элонгации G из Е.coli (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино-трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун-штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

Исследования первичной структуры α- и β-цепей гемоглобина способствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями. Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре β-цепей (реже α-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать следующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генетически. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уникальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные комбинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

Читайте так же:  Какие витамины в черешне

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вторичная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, определяющие ее общую пространственную конформацию.

Определение аминокислотной последовательности в белке

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Фенилизотиоционат (ФИТЦ) — реагент, используемый для определения N-концевой аминокислоты в пептиде. Он способен реагировать с α-аминогруппой и α-карбоксильной группой свободных аминокислот, а также с N-концевой аминокислотой в пептидах (см. схему ниже).

В результате взаимодействия с N-концевой аминокислотой полипептида образуется фенил-тиогидантионовое производное, в котором дестабилизирована пептидная связь между α-карбоксильной группой N-концевой аминокислоты и α-аминогруппой второй аминокислоты в пептиде. Эта связь избирательно гидролизуется без повреждения других пептидных связей.

После реакции выделяют комплекс ФИТЦ-АК1, идентифицируют его хроматографическими методами. ФИТЦ можно использовать вновь с укороченным пептидом, полученным в предыдущем цикле, для определения следующей аминокислоты. Этот процесс ступенчатого расщепления пептида с N-конца был автоматизирован и реализован в приборе — секвенаторе, с помощью которого можно определять последовательность аминокислотных остатков в олигопептидах, состоящих из 10-20 аминокислот.

Многие полипептиды имеют первичную структуру, состоящую более чем из 100 аминокислот. Так как с помощью секвенаторов наиболее продуктивно определяют аминокислотную последовательность лишь небольших пептидов, молекулы полипептида расщепляют по специфическим местам на фрагменты.

Используя несколько разных расщепляющих агентов (ими могут быть ферменты или химические вещества) в разных пробах очищенного полипептида, можно получить частично перекрывающие друг друга фрагменты с установленной аминокислотной последовательностью. С их помощью можно воссоздать правильный порядок фрагментов и получить полную последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Ферментативное расщепление полипептида по специфическим участкам

Для специфического расщепления пептидных связей в белке можно использовать несколько разных ферментов. Наиболее широко используют ферментативный гидролиз полипептида протеолитическим ферментом — трипсином, который относят к группе пищеварительных ферментов (его вырабатывает поджелудочная железа). Фермент обладает высокой специфичностью действия. Он расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа остатков лизина или аргинина.

Исходя из установленного количества остатков лизина и аргинина, можно предсказать количество получаемых при гидролизе трипсином фрагментов. Так, если в полипептидной цепи 6 остатков аргинина и лизина, то при расщеплении трипсином можно получить 7 фрагментов. Затем в каждом фрагменте устанавливают аминокислотную последовательность.

Химическое расщепление полипептида по специфическим участкам

В некоторых случаях предпочтителен не ферментативный, а химический гидролиз. Так, реагент бромциан расщепляет только пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит остатку метионина. Зная количество остатков метионина в полипептидной цепи, легко установить количество получаемых фрагментов. Далее для каждого фрагмента в секвенаторе также устанавливают аминокислотную последовательность.

Получение аминокислотной последовательности полипептида с помощью перекрывающихся фрагментов

Для успешного установления последовательности полученных фрагментов полипептида необходимо получить пептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Это достигают обработкой отдельных проб данного полипептида разными реагентами, расщепляющими белок в разных местах. Необходимо провести столько расщеплений, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих перекрывание всех участков, необходимых для определения последовательности исходного полипептида.

Рис. 4. Установление первичной структуры белка с помощью перекрывающихся пептидных фрагментов.

4. Отдельные представители пептидов: аспартам, глутатион.

Один из наиболее распространенных представителей трипептидов — глутатион — содержится в организме всех животных, в растениях и бактериях.

Цистеин в составе глутатиона обусловливает возможность существования глутатиона как в восстановленной, так и окисленной форме.

Глутатион участвует в ряде окислительно-восстановительных процессов. Он выполняет функцию протектора белков, т.е. вещества, предохраняющего белки со свободными тиольными группами SH от окисления с образованием дисульфидных связей -S-S-. Это касается тех белков, для которых такой процесс нежелателен. Глутатион в этих случаях принимает на себя действие окислителя и таким образом «защищает» белок. При окислении глутатиона происходит межмолекулярное сшивание двух трипептидных фрагментов за счет дисульфидной связи. Процесс обратим.

[1]

Аспартам — дипептид, состоящий из остатков L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина, используется в качестве заменителя сахара – низкокалорийной пищевой добавки. Почти в 200 раз слаще сахарозы.

Видео (кликните для воспроизведения).

Дата добавления: 2015-05-26 ; просмотров: 3993 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источники


  1. Боровская, Э. Здоровое питание школьника / Э. Боровская. — Москва: Машиностроение, 2010. — 320 c.

  2. Епифанов, В. А. Лечебная физическая культура и массаж / В.А. Епифанов. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. — 528 c.

  3. Багмут, С.И. Интерьер предприятий общественного питания / С.И. Багмут. — М.: Экономика, 1976. — 446 c.
Определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи
Оценка 5 проголосовавших: 1

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here